5. Физиологические явления как обратимые кооперативные переходы, контролируемые индуктивным эффектом

В покоящихся мышечных волокнах лягушки при физиологических температурах ионы К⁺ адсорбируются на β- и γ-карбоксильных группах в стехиометрии 1:1, а молекулы воды — на CONH-группах полипептидного остова белков в виде многослойной структуры из поляризованных и ориентированных молекул. Однако достаточно небольшого подъема температуры (лишь на 10 °С), чтобы мышечные волокна погибли. При этом и К⁺, и клеточная вода высвобождаются из связанного состояния. Подчеркнем особо: столь высокая чувствительность клетки к температуре свидетельствует не только о низкой энтропии протоплазмы, но и о том, что механизмы, лежащие в основе наблюдаемых изменений состояния клеточного К⁺ и воды, — по своей природе электронные, и могут быть количественно выражены изменениями показателей, названных «величиной с» и «аналогом величины с» (то есть изменениями плотности электронов на отрицательных фиксированных зарядах и отрицательных полюсах диполей соответственно).

5.1 Электронная плотность на функциональных группах белка — пульт управления жизнедеятельностью

В 1902 году Э. Овертон обнаружил, что для мышечного сокращения необходим Na⁺ (или Li⁺) в среде. Почти через полвека Ходжкин и Катц выяснили, что возбуждение нервного или мышечного волокна сопровождается локальным повышением проницаемости «мембраны» для Na⁺. При этом Na⁺ стремительно входит в цитоплазму, что и приводит к потенциалу действия. Если в окружающей среде нет Na⁺ — не будет ни потенциала действия, ни возбудимости. На основе этих данных была создана теория потенциала действия Ходжкина и Хаксли, опубликованная в 1952 году. Хотя авторами внесен неоценимый вклад в данную область, а их теория потенциала действия была действительно красивой, ей не суждена была долгая жизнь. Теперь мы знаем, что потенциал покоя — это никакой не трансмембранный потенциал, поэтому и теория потенциала действия оказалась основанной на ложных предпосылках. При таких обстоятельствах потребовалось новое теоретическое объяснение.

Такое объяснение Линг предложил в 1955 году. Он исходил из того, что потенциал покоя клетки имеет много общего с потенциалом стеклянного электрода. Оба возникают благодаря присутствию на поверхности фиксированных анионных центров. На поверхности нервных и мышечных волокон эти центры представляют собой β- и γ-карбоксильные группы, избирательные в состоянии покоя к К⁺. Таким образом, поверхность клетки в покое играет роль калий-чувствительного стеклянного электрода. Однако в состоянии возбуждения она превращается в натрий-чувствительный электрод.

Ключ к механизму такого превращения был найден в ионообменных смолах, свойства которых играли важную роль в становлении ТФЗЛ в 1952 году. Сульфонатный тип ионообменных смол избирателен к К⁺ в присутствии Na⁺, а карбоксильные ионообменные смолы — наоборот. Брегман приписывал избирательность к К⁺ сильным кислотным группам, а избирательность к Na⁺ — слабым. Он объяснял эти различия разной поляризуемостью их кислотных групп, как ранее это делал Бунгенберг-де-Йонг с сотрудниками.

Идея Эйзенмана, Рудина и Кесби о том, что изменение ионной избирательности может быть вызвано изменением напряженности поля вокруг анионных центров стекла, подтолкнуло Линга продолжить развитие ТФЗЛ. Результатом этих усилий стала ТАИ. Эта фундаментальная физико-химическая теория живой клетки стоит на том, что смена физиологических состояний означает изменения электронной плотности на атомах кислорода β- и γ-карбоксильных групп и на функциональных группах пептидной связи в масштабах всей клетки или отдельных ее структур, и что эти изменения можно количественно описать с помощью параметра «величина с».

«Величина с» (исчисляющаяся в ангстремах) — независимый параметр, от значений которого зависят константы диссоциации кислотных групп, а значит, и их рК. Так, уксусная кислота СН₃СООН обладает высоким рК, равным 4,75. Соответственно, она имеет высокую «величину с», т.е. относительно высокую плотность электронов на кислотной группе. При замещении одного из метильных атомов водорода атомом хлора образуется монохлоруксусная кислота СlСН₂СООН. Атом хлора сильнее притягивает электроны, чем замещенный им атом водорода. В результате индуктивного эффекта (перераспределения электронной плотности в молекуле) электронная плотность на карбоксильном атоме кислорода снижается. Снижение плотности заряда (уменьшение «величины с») уменьшает сродство отрицательно заряженной карбоксильной группы к положительно заряженным протонам (Н⁺), в результате чего ее рК снижается до 2,8. При замещении двух атомов водорода на хлор образуется дихлоруксусная кислота, чья рК составляет 1,3, а «величина с» снижается еще больше. Наконец, при замещении всех трех атомов водорода атомами хлора образуется трихлоруксусная кислота, чья рК меньше единицы, а «величина с» крайне низка. Это — яркий пример индуктивного влияния одних функциональных групп на свойства других, удаленных групп, в пределах одной молекулы.

Определившись с «величиной с» как с количественной мерой плотности электронов и выбрав полипептидную цепь в качестве линейной модели, Линг вычислил энергию ассоциации с ней 5 ионов щелочных металлов, а также Н⁺ и NH4⁺ (ион NH4⁺ служил также моделью для описания свойств фиксированных катионов). Исследование свойств такой модели показало, что изменение «величины с», в самом деле, может повлечь за собой появление избирательности к К⁺ в присутствии Na⁺ или, наоборот, — к Na⁺ в присутствии К⁺. Что не менее важно — полученные данные позволяют объяснить, как изменение «величины с» влияет на образование или разрыв солевых связей.

В отличие от «величины с» β- и γ-карбоксильных групп, расположенных на коротких боковых радикалах, «аналог величины с» отражает электронную плотность на карбонильных атомах кислорода (иминогруппа пептидной связи поляризуется значительно слабее), расположенных прямо на полипептидном остове. Взаимосвязь между «аналогом величины с» и избирательностью взаимодействия этих групп была выведена из следующих фактов и предположений:

1. Склонность пептидной группы NHCO включаться в α-спирали (или β-складчатые структуры) напрямую зависит от электронодонорной силы боковой группы, примыкающей к данной пептидной связи.
2. Электронодонорную силу боковой группы можно определить по рК соответствующей (гомологичной) карбоновой кислоты (например, уксусной кислоты для аланина, муравьиной кислоты для глицина и т.д.).
3. Склонность каждого аминокислотного остатка (боковая цепь и прилегающие к ней функциональные группы пептидной связи) образовывать α-спиральную, β-складчатую конформацию или конформацию случайного клубка (полноразвернутую конформацию) можно установить эмпирически.

Итог анализа свойств функциональных групп пептидной связи и, прежде всего, карбонильного кислорода сводится к тому, что показана положительная линейная корреляция (с коэффициентом корреляции около 0,75) между α-спиральными потенциалами (склонностью вступать в водородные связи) 19 аминокислотных остатков и значениями рК гомологичных им карбоновых кислот. Столь сильная корреляция, в свою очередь, позволила выяснить природу избирательности карбонильных атомов кислорода полипептидного остова: при высоком значении «аналога величины с» (т.е. при высокой плотности электронов на них) остов полипептида предпочитает образовывать α-спиральную конформацию, а при низком «аналоге величины с» он предпочитает адсорбировать, поляризовать и ориентировать молекулы воды с образованием многослойных ассоциатов из ее молекул.

5.2 Смена избирательности ключевых функциональных групп белка — физиологический смысл индуктивного эффекта

Изменение кислотности уксусной кислоты в ряду ее хлорпроизводных (см. выше) — классический пример индуктивного эффекта. В этом случае он возникает благодаря разрыву одних ковалентных связей (с водородом) и образованию других (с хлором). Мишенью индуктивного эффекта здесь служит так называемая ионная связь между карбоксильной группой и Н⁺. Однако ТАИ подразумевает, что явление индуктивного изменения электронной плотности на функциональных группах распространено гораздо шире, чем это может показаться. Так, водородные связи, их образование и разрыв, тоже могут служить мишенями индуктивного эффекта, распространяющегося на гораздо большие расстояния, чем размер молекулы уксусной кислоты. Сама смена контрагентов по взаимодействию с функциональными группами белка (от К⁺ к Na⁺, от водородных связей во вторичных структурах белка к водородным связям с молекулами воды) также может инициировать дальнодействующий индуктивный эффект. Экспериментальные данные в пользу такого взгляда известны давно. Новым является их последовательное применение для объяснения фундаментальных физиологических явлений.

Это расширение роли индуктивного эффекта необходимо для физиологии клетки потому, что энергия активации, необходимая для разрыва и образования водородных и ионных связей, достаточно мала, чтобы эти процессы происходили самопроизвольно даже при физиологических температурах, тогда как энергия активации, сопряженная с разрывом и образованием ковалентных связей, обычно слишком велика, чтобы это могло происходить самопроизвольно, без участия специальных ферментов или других факторов. «Величина с» и «аналог величины с» представляют собой количественную меру различий в прочности ионных и водородных связей, а кардинальные адсорбаты осуществляют дальнодействующее влияние на «величину с» и «аналог величины с» различных функциональных групп, что ведет к образованию или диссоциации ионных или водородных связей в масштабе макромолекулы и клетки в целом.

5.3 Классификация кардинальных адсорбатов, включая биологически активные вещества

Увы, современная фармакология, также как и фармакология прошлого, не идет дальше простой констатации очевидного: молекулы лекарственного средства взаимодействуют с соответствующими им стереоспецифическими рецепторными центрами, вызывая в них конформационные изменения. И на этом все. Вы нигде не найдете ответа на вопрос, почему эти изменения происходят. Самое трудное — дать объяснение очевидному. Что касается ТАИ, то она с самого начала рассматривала клетку как электронную машину, изменение электронных плотностей в которой находится под контролем кардинальных адсорбатов, к числу которых относятся и биологически активные соединения, входящие в состав БАДов. Можно выделить три основных типа кардинальных адсорбатов: электронодонорные кардинальные адсорбаты (ЭДКА), электроноакцепторные (ЭАКА) и электроноиндифферентные (ЭИКА).

5.4 Как клетка поддерживается в состоянии покоя и что происходит при его изменении — роль кардинальных адсорбатов

Когда АТФ и ее вспомогательные факторы находятся на своих местах, другие кардинальные адсорбаты — такие, как инсулин, адреналин или уабаин — могут проводить тонкую настройку структуры клетки для выполнения определенных функций, необходимых на данный момент.

5.4.1 Поддержание живого состояния при помощи АТФ — электроноакцепторного кардинального адсорбата

АТФ отличается от всех остальных кардинальных адсорбатов: она — главный кардинальный адсорбат и, играя ключевую роль, способна самостоятельно (или при участии вспомогательных факторов) поддерживать живое состояние протоплазмы. Другие кардинальные адсорбаты могут лишь настраивать структуру клетки для выполнения всего спектра физиологических функций.

Распределение веществ между клеткой и средой

Одно из главных назначений АТФ как ЭАКА состоит в поддержании β- и γ-карбоксильных групп белков в состоянии, когда они селективно связывают К⁺ в присутствии Na⁺. Это достигается благодаря способности АТФ снижать плотность электронов («величину с») на указанных группах в масштабе макромолекулы, а затем и всей клетки в целом. Кроме того, АТФ, действуя как акцептор электронов, удерживает ключевые белки клетки в полноразвернутой конформации, снижая плотность электронов («аналог величины с») на карбонильных группах полипептидного остова. Сдвиг электронной плотности в этом направлении приводит к смене селективности этих групп от водородных связей с иминогруппами (в α-спиралях, например) к водородным связям с водой. Это приводит к развертыванию белковой молекулы и ее взаимодействию с водой с образованием многослойных структур из поляризованных и ориентированных молекул воды в масштабе, в конечном счете, всей клетки. Величина q гидратированного Na⁺ и сахарозы в такой структурированной воде значительно меньше 1 (в соответствии с правилом размера), то есть их концентрация в клеточной воде ниже, чем в среде.

Проницаемость клеточной мембраны

Ключевые белки клеточной «мембраны» (т.е. поверхности клетки) обладают тем же фундаментальным свойством, что и ключевые белки всей протоплазмы — селективность их функциональных групп определяется АТФ. При истощении запасов АТФ в клетке или при ее удалении любым другим способом связанная вода на клеточной поверхности десорбируется и диффузионный барьер из слоев структурированной воды разрушается. Эти структурные изменения приводят к скачкообразному увеличению проницаемости клетки в микроскопически тонком поверхностном слое. Однако такие изменения могут произойти и в масштабе всей клетки.

Регуляция клеточного объема

В интактных клетках с нормальным уровнем АТФ «величина с» внутриклеточных β- и γ-карбоксильных групп низка, поэтому они избирательны к К⁺ в присутствии Na⁺. Именно по этой причине такие мышцы набухают в изотоническом растворе КCl — сродство фиксированных анионов к К⁺ выше, поэтому их связи с фиксированными катионами (солевые связи) разрываются. Из-за низкого сродства фиксированных анионов к Na⁺ изотонический раствор NaCl набухания не вызывает. Однако при повреждении уровень АТФ в клетке падает. Из-за утраты главного ЭАКА (АТФ) плотность электронов на β- и γ-карбоксильных группах увеличивается, а с ней возрастает и их избирательность к Na⁺. В этих условиях обычно безобидный Na⁺ крови обретает способность вызывать патологическое набухание поврежденных клеток, действуя подобно ионам К⁺ в интактных клетках.

Потенциал покоя

Потенциал покоя, как и ионная проницаемость, определяется АТФ благодаря ее способности изменять селективность фиксированных анионов белка в пользу ионов К⁺. Для поддержания нормального потенциала покоя в мышце необходим также главный конгруэнтный анион мышечного волокна — креатинфосфат (КрФ). Обработка метаболическим ядом или сочетание отравления с повторяющимися электрическими импульсами влечет за собой постепенное снижение уровня КрФ, вместе с которым постепенно уменьшается и потенциал покоя волокна. При полном истощении АТФ потенциал покоя исчезает.

5.4.2 Модуляция состояния покоя уабаином — электроно-донорным кардинальным адсорбатом

Фармакологическое действие всех, кроме АТФ, кардинальных адсорбатов, заключается в определенной настройке состояния покоя, создаваемого и поддерживаемого АТФ и ее помощниками.

Здесь будет рассмотрено влияние лишь одного препарата — сердечного гликозида уабаина, хотя есть немало и других примеров, включая совместное действие двух и более кардинальных адсорбатов.

Распределение веществ между клеткой и средой

В простом опыте по влиянию уабаина на распределение К⁺ и Na⁺ между клеткой и средой Линг с сотрудниками инкубировали в стерильных условиях при 25 °С четыре небольшие мышцы лягушки общим весом около 400 мг, из которых около 60 мг приходилось на жидкость в межклеточном пространстве и соединительной ткани. Оставшиеся 340 мг — «чистые» мышечные волокна. После 72 часов инкубации в растворе Рингера с уабаином (0,11 л раствора, концентрация уабаина 3,26 * 10^-7 М) установилось новое равновесное распределение, при котором практически все 0,11 моль/кг К⁺ были замещены зквимолярным (0,11 моль/кг) количеством Na⁺.

Этот эксперимент поставил вопрос, важность которого трудно переоценить: как столь ничтожное количество уабаина может вызвать полное замещение столь большого количества К⁺ в клетке на Na⁺?

В книге Линга дан подробный ответ на этот вопрос — он аналитически рассмотрен с трех сторон: с позиций исторически первой версии мембранной теории, затем ее надстройки в виде теории мембранных насосов и, наконец, с точки зрения ТАИ.

Поскольку данный материал представляет собой по большей части чисто академический интерес, мы — дабы не перегружать изложение — опускаем его и ограничиваемся лишь фундаментальным выводом: уабаин вызывает замещение в масштабе всей клетки адсорбированного К⁺ эквимолярным количеством Na⁺, никак не влияя при этом на связанное состояние клеточной воды.

Для дальнейшего рассмотрения этого вопроса нам необходимо оценить количество β- и γ-карбоксильных групп, селективность которых переключается с К⁺ на Na⁺ под действием всего одной молекулы уабаина. Будем исходить из того, что все присутствующие в растворе молекулы уабаина (количество которых равно 0,11 х 3,26 х 10^-7 или 3,59 х 10^-8 моль) поглощаются мышечным волокном и связываются в нем со своими кардинальными центрами (рецепторами). Общее количество β- и γ-карбоксильных групп, в которых под влиянием уабаина происходит замена К⁺ на Na⁺ согласно данным эксперимента, равно 0,11 х 3,40 х 10^-4 или 3,74 х 10^-5 моль. Разделив число молекул уабаина в мышце (3,59 х 10^-8 моль) на количество β- и γ-карбоксильных групп, свойства которых он изменил (3,74 х 10^-5 моль), мы получаем, что каждая молекула уабаина контролирует селективность 1042 β- и γ-карбоксильных групп.

Разве не удивительно, что адсорбция всего лишь одной молекулы уабаина клеточными структурами приводит к десенсибилизации к К⁺ более тысячи β- и γ-карбоксильных групп?! А ведь каждый из этих 1042 ионов К⁺ или заместившего его Na⁺ является не частью хаотичного потока ионов, из чего исходит мембранная теория, а адсорбирован β- или γ-карбоксильными группами белков (в соотношении 1:1) и организован в клеточном пространстве в регулярные структуры, которыми являются и сами белки-адсорбенты, и образованные ими структуры. При этом каждый акт связывания индивидуален и локализован. Поскольку свойства ионов К⁺ и Na⁺ относительно стабильны, различия в их взаимодействии с каждой из β- и γ-карбоксильных групп отражают изменение параметров ближнего взаимодействия с ними со стороны самих карбоксильных групп — таких, например, как локальная электронная плотность на них — величина с.

Можно сказать и по-другому: ничтожное количество уабаина каким-то образом превращает протоплазматическую «ионообменную смолу» из смолы сильнокислотного сульфонатного типа (селективного к К⁺ в присутствии Na⁺) в смолу слабокислотного карбоксильного типа (с большим сродством к Na⁺). Такое изменение невозможно объяснить каким-то особым размером пор в смоле. Не может это быть обусловлено и поляризуемостью функциональных групп коллоидов под влиянием свободных ионов, как предполагал Бунген-берг-де-Йонг в 1940-х годах. Однако различную селективность смол может объяснить идея Эйзенмана, Рудина и Кесби — идея о различной плотности электронов, количественным выражением которой является «величина с», предложенная в процессе развития ТФЗЛ.

Если все дело в изменении «величины с» β- и γ-карбоксильных групп белков под влиянием уабаина, то тогда его действие должно подчиняться правилу «все или ничего». Физики, изучая неживой мир, обнаружили, что этому правилу подчиняются так называемые ферромагнитные, или (авто)кооперативные явления, для которых характерна высокая положительная энергия взаимодействия соседних центров (-γ/2). Но коренное отличие биологических автокооперативных явлений в том, что соседние центры, взаимодействующие в биологических системах, расположены друг от друга гораздо дальше, чем в тех же ферромагнетиках.

Теоретически, и падение костяшек домино, и передача дымовых сигналов по Великой китайской стене, и взаимодействие соседних центров в белке могут распространяться на сколь угодно большое расстояние без угасания. Как медный провод объединил в свое время мир, так и индуктивный эффект благодаря своей чрезвычайной экономичности и дальнодействию может служить уникальным свойством протоплазмы, объединяющим различные ее составляющие в согласованную, интегрированную систему. В основе механизма интегрирования лежит уникальная особенность всех белков — резонансная природа полипептидной цепи (кето-енольная таутомерия), ассоциирующаяся с резонансными структурами ароматических соединений, например.

Не исключено, что действие уабаина на β- и γ-карбоксильные группы опосредовано его влиянием на другие кардинальные адсорбаты. Но одно бесспорно: в использованных концентрациях (3,26 х 10^-7 М) уабаин никак не влияет на уровень АТФ в клетке. Даже если действие уабаина опосредовано, это не меняет сути: его действие в конечном счете выражается в изменении сродства β- и γ-карбоксильных групп, что приводит к важным последствиям для физиологического состояния клетки.

Проницаемость клеточной мембраны

В опытах по ингибированию поступления меченого Cs⁺ в яйцеклетки лягушки под влиянием Rb⁺ и Na⁺ Линг и Фу показали, что присутствие уабаина повышает сродство поверхностных β- и γ-карбоксильных групп к Na⁺, и снижает к Rb⁺. Уабаин играет роль ЭДКА, вызывая повышение «величины с» (увеличение электронной плотности) у всех карбоксильных групп, как это следует из данных по изменению характера равновесного распределения ионов между мышцами лягушки и средой под влиянием уабаина.

Регуляция клеточного объема

Истощение АТФ, как известно, сопровождается набуханием клетки, степень которого зависит от уровня Na⁺ в окружающей среде. Теоретически, эффекты истощения количества в клетке какого-либо ЭАКА (такого, как АТФ, например) и увеличения содержания в ней какого-либо ЭДКА (например, уабаина) должны быть сходными (и в том, и в другом случае плотность электронов на ключевых функциональных группах белков возрастает). Это предсказание ТАИ было подтверждено в работе Линга и Бора: уабаин в концентрации 3,26 х 10^-7 М, слишком низкой, чтобы влиять на уровень АТФ, вызывает набухание мышечных волокон, степень которого зависит от концентрации Na⁺ в среде.

Потенциал покоя

Акаике получил чрезвычайно важные данные по влиянию охлаждения и уабаина на зависимость потенциала покоя мышцы с повышенным содержанием Na⁺ от концентрации K⁺ в среде. Если данные Акаике проанализировать при помощи уравнения потенциала покоя Линга (учитывающего кооперативное взаимодействие соседних центров адсорбции), то становится очевидным, что уабаин действует как ЭДКА, вызывая повышение «величины с» у всех β- и γ-карбоксильных групп на поверхности мышечных волокон, автокооперативно повышая их сродство к Na⁺ и снижая к К⁺.

5.5 Обратимые физиологические явления

5.5.1 Истинный активный транспорт

У животных, живущих в пресных водах с концентрацией Na⁺ лишь около 0,2 мМ, содержание Na⁺ в крови составляет около 100 мМ — в 500 раз больше. Значит, те же лягушки способны поглощать этот ион из окружающей среды.

Установлено, что кожа лягушки чрезвычайно слабо проницаема для сахарозы. Поскольку величины q для сахарозы и Na⁺ зачастую мало отличаются, можно ожидать, что скорость проникновения Na⁺ также будет низка из-за мощного диффузионного барьера, которым является структурированная вода на наружной поверхности («мембране») эпителиальных клеток. Поэтому для того, чтобы объяснить движение Na⁺ в организм лягушки — против градиента концентрации 500:1 — одной проницаемости мало. В ТАИ механизм истинного активного транспорта состоит из двух «мембран», действующих подобно клапанам, белка-аккумулятора между ними, периодически связывающего и высвобождающего Na⁺ и трех этапов.

1. Наружная поверхность кожи лягушки содержит большое количество β- и γ-карбоксильных групп с высокой плотностью электронов на них, благодаря чему они избирательно и прочно адсорбируют Na⁺. Локальная концентрация этого катиона на поверхности кожи становится гораздо выше, чем в среде. В этом заключается первый этап транспорта Na⁺.
2. Затем накопившиеся на поверхности клетки ионы Na⁺ проникают в нее путем дублетной и/или триплетной адсорбционно-десорбционной диффузии. Проникнув внутрь, они адсорбируются β- и γ-карбоксильными группами белка-аккумулятора, избирательность которых зависит от АТФ, а также от других, вспомогательных кардинальных адсорбатов (совместное действие всех факторов приводит к увеличению плотности электронов на этих группах, и поэтому их сродство становится выше к Na⁺; пример — совместное действие АТФ с уабаином). Когда количество адсорбированного Na⁺ достигает порога, активируется Na,K-АТФаза белка-аккумулятора, и АТФ расщепляется.
3. За расщеплением АТФ следует десорбция Na⁺ со всех белков-аккумуляторов (то есть с Nа⁺-аккумулирующего белкового матрикса). Одновременно десорбируется и связанная вода цитоплазмы и внутренней «мембраны» эпителиальной клетки. В клетке возникает объем со свободной водой, хорошо растворяющей Na⁺ — своего рода канал, ведущий из клетки во внутреннюю среду организма. По этому туннелю, «прорубленному» в толще связанной воды, свободный Na⁺ выходит из эпителиальной клетки в кровоток, вода в котором также свободна. Регенерация АТФ знаменует подготовку к следующему циклу.

Данная модель истинного активного транспорта через кожу лягушки требует от эпителиальных клеток участия в циклических (обратимых) процессах, которые трудно зарегистрировать ввиду малого размера клеток. Однако Брукс успешно продемонстрировал циклическое поглощение Rb⁺ из окружающей среды протоплазмой Nitella с последующим циклическим высвобождением этого иона в центральную вакуоль.

5.5.2 Потенциал действия

Разгадка такого явления, как потенциал действия, — величайшее достижение физиологии клетки в XX веке. Но, как уже неоднократно говорилось, мембранная теория, на принципах которой основано объяснение этого феномена, по своей сути, увы, неверна. В нервных и мышечных волокнах «течет» вовсе не разбавленный раствор свободных электролитов в свободной воде, как это считалось сто лет назад, и в чем большинство убеждено и теперь. Мембранный потенциал существует только в воображении апологетов мембранной теории, а не в реальном мире живых и искусственных мембран. Ни одному ученому не удалось показать, что изменение уровня К⁺ в клетке влияет на потенциал покоя. Потенциал покоя безразличен и к уровню ионов Сl^-, и Mg²⁺ в окружающей среде, несмотря на то, что «мембрана» для них легко проницаема. Есть и другие свидетельства, резко противоречащие принципам теории потенциала действия Ходжкина и Хаксли. Так, например, натриевого потенциала по Ходжкину и Хаксли не может быть в принципе. Невозможен и так называемый натриевый канал, столь же бессмысленный, как и канал, построенный в открытом море.

Согласно ТАИ, потенциал действия, как и потенциал покоя, на основе которого он развивается, представляет собой электрическое явление, возникающее благодаря β- и γ-карбоксильным группам, рассыпанным по поверхности клетки. Потенциал действия — автокооперативный процесс, распространяющийся по поверхности протоплазмы нервного или мышечного волокна или другой возбудимой клетки. Он сопровождается временным согласованным повышением «величины с» всех поверхностных β- и γ-карбоксильных групп, что приводит к резкой смене их сродства с К⁺ на Na⁺. Одновременно происходит увеличение «аналога величины с» всех карбонильных групп полипептидного остова белков, ведущее к деполяризации воды в поверхностных слоях клетки, превращению ее в обычную воду и к соответствующему росту величины q для ионов Na⁺, сахарозы и других веществ.

В пользу такого понимания говорят данные о временном повышении рК поверхностных β- и γ-карбоксильных групп белков, ответственных за поступление Na⁺ в клетку, и о временной смене их избирательности с характерного для состояния покоя порядка Rb⁺ > К⁺ > Na⁺, соответствующего низкой «величине с», на обратный порядок, свидетельствующий о резком увеличении плотности электронов на этих группах.

Объяснение потенциала действия, предложенное ТАИ, находит подтверждение в данных Тасаки с сотрудниками, показавших, что прохождение потенциала действия по нерву краба сопровождается стремительным локальным набуханием аксона, по времени совпадающим с потенциалом действия.

Триумфом ТАИ явилась работа Виллегаса, Блей и Виллегаса, блистательно показавших, что во время потенциала действия поверхность аксона кальмара становится на мгновение более проницаемой для крупных молекул эритритола, маннита и сахарозы, если в среде присутствует Na⁺. Это Nа⁺-зависимое повышение неизбирательной проницаемости для неэлектролитов с большим молекулярным объемом идеально соответствует пониманию потенциала действия ТАИ. Подчеркнем еще раз, что распад ионо-водо-белкового комплекса с АТФ приводит к перераспределению электронной плотности в молекуле белка и, как следствие, к одновременному наступлению ряда событий, в том числе к изменению поверхностного адсорбционного электропотенциала и десорбции воды. Именно это последнее ведет к разрушению диффузионного барьера на поверхности клетки, и крупным молекулам становится легче проникать в нее. Ионы Na⁺, адсорбируясь на места, занимавшиеся К⁺, значительно ускоряют распад ионо-водо-белкового комплекса. Поэтому эти ионы так необходимы. Соответствие данных упомянутой работы требованиям ТАИ превзошло самые смелые ожидания. Ведь авторы этого первоклассного исследования о ТАИ ничего не знали!

6. Мертвое состояние

Физико-химическая теория жизни была бы неполной, если бы ее не завершала физико-химическая теория смерти: ведь жизнь и смерть — это два состояния одной и той же структуры — протоплазмы.

6.1 Жизнь и смерть протоплазмы

Когда Томас Хаксли прочел в 1869 году одну из своих знаменитых воскресных лекций «Физическая основа жизни», ему ответили не только горячими аплодисментами, но и резким несогласием. Так, шотландский философ Джеймс Хатчинсон Стерлинг выступил с концепцией единого вещества, воплощениями которого были и омар, и баранина, и ростбиф, и сам человек, который всем этим питается. Стерлинг явно упустил из виду очевидное различие между прожаренным ростбифом и живым человеком. Чтобы парировать аргументы своих противников, Хаксли нужно было дать определение жизни и смерти на субклеточном уровне. Только так можно было провести границу между жареным и живым. Однако тогда рассмотреть этот вопрос на таком уровне было непросто, в чем можно убедиться на других примерах из истории науки.

Август Вейсман (1834-1915), разделявший живое вещество на зародышевую плазму и сому, оказался в затруднительном положении, когда попытался объединить их в более широкое понятие, каким является протоплазма. Ему пришлось признать, что, поскольку на тот момент никто не представлял себе разницы между мертвым «протеидом» и живым, можно лишь сделать предположение, что суть различий кроется на физико-химическом уровне. Уже в наше время, когда физико-химические подходы в биологии стали еще более актуальными, историк Томас Холл попытался бросить свежий взгляд на эту проблему. Однако все, что ему удалось — это привести череду мнений современных биологов (живо напоминавших застарелую «теорию» Стерлинга), что границу между жизнью и смертью можно провести только на уровне целой клетки, что это невозможно сделать на уровне ее структуры — протоплазмы.

Знал ли Холл, что такая возможность появилась еще за 7 лет до его публикации? Что это стало возможным благодаря физической теории жизни Линга, теории ассоциации-индукции? Вряд ли.

В книге Линга и, в частности, в одной из наших статей, содержится достаточно материала для размышлений на эту тему. Феномен жизни может и должен поддаваться пониманию и на субклеточном уровне, а не только на уровне целой клетки. Основа для такого понимания — физико-химические свойства фундаментальной структуры — протоплазмы. Работа именно этой структуры обеспечивает все формы жизнедеятельности.

6.2 Как протоплазма умирает

Согласно ТАИ, покоящееся живое состояние — это состояние метастабильного равновесия. Подобно монете, стоящей на ребре, система в метастабильном состоянии может легко выйти из равновесия вследствие любого возмущения. Ограничимся в данном контексте лишь двумя: нагреванием и отравлением.

Говоря о гибели мышцы лягушки от нагревания (см. ранее по тексту), важно понимать, что движущей силой этой трансформации является прирост энтропии. Однако мышца лягушки погибает при температуре, которая является нормальной для тканей птиц, например, не говоря уже о микроорганизмах. Выходит, что одно и то же повышение температуры гибельно для протоплазмы одних клеток и безразлично для других. Может ли связанный со смертью прирост энтропии столь сильно различаться в протоплазме лягушек и птиц? Нет, потому что величина q ионов Na⁺ (и сахарозы), численно отражающая физическое состояние клеточной воды, мало отличается в клетках различных животных и даже растений.

Различие летальных температур обусловлено различием сил, стабилизирующих структуру живой протоплазмы — к примеру, прочностью солевых связей. Такое объяснение согласуется с теорией термостабильности живых организмов Перутца: в одних и тех же ферментах, выделенных из более термостабильных бактерий, содержится больше солевых связей. Несмотря на то, что конечный результат летального действия температуры и ядов — один, последние убивают клетку другим способом.

Хотя мышцы лягушки обрабатывали десятью ядами с совершенно разными токсикологическими характеристиками, смерть наступала при одинаковом, критическом, падении уровня АТФ в клетке. Это подтверждает справедливость постулата ТАИ о ключевой роли АТФ в поддержании живого состояния. Поскольку АТФ является ЭАКА, ее потеря влечет за собой критическое (надпороговое) увеличение электронной плотности на всех ключевых функциональных группах белков — на β- и γ-карбоксильных группах и на карбонильных группах полипептидного остова (повышение «величины с» и «аналога величины с», соответственно). Поэтому в гибнущей протоплазме происходит десорбция К⁺ и воды. И, что забавно, белки в погибшей клетке приобретают конформацию, близкую к так называемой «нативной», т.е. той, с которой работают в лабораториях.

6.3 Анатомия мертвой протоплазмы

В ТАИ покоящееся живое состояние представляет собой состояние с большим запасом энергии и низкой энтропией. Нагревание разрушает это состояние, высвобождая связанные К⁺ и воду, приводя к росту энтропии. Яды приводят к тому же результату, но посредством подавления процесса регенерации АТФ.

Рост плотности электронов (или плотности заряда) на карбонильных группах полипептидного остова при истощении АТФ способствует десорбции клеточной воды. Освобождающиеся из связи с водой СО- и NH-группы пептидных связей могут участвовать в образовании α-спиральной структуры или β-складчатого листа. С ростом плотности заряда на β- и γ-карбоксильных группах (с ростом «величины с») адсорбированный К⁺ замещается на Na⁺ или на фиксированные катионы (при образовании солевых связей между фиксированными зарядами). Однако, по имеющимся данным, Na⁺ адсорбируется не полностью и на короткое время, также замещаясь вскоре фиксированными катионами, образующими более прочные связи с фиксированными анионами, чем Na⁺. Именно образование солевых связей внутри молекул белка и между ними объясняет, почему протоплазма погибших мышц плотнее, чем у живых, и менее податлива, чем насыщенная ионами Na⁺ карбоксильная ионообменная смола. При этом солевые связи между фиксированными зарядами образуются несмотря на то, что окружающая среда, будь то морская вода, кровь, тканевая жидкость или раствор Рингера, обычно богата ионами Na⁺.

Все эти изменения при умирании можно проследить от автокооперативного разрушения протоплазматического ансамбля белков, воды и ионов до полного формирования всех солевых связей между фиксированными анионами и фиксированными катионами. В живом состоянии АТФ и К⁺ адсорбированы, а вода поляризована, ориентирована и ограничена в своей подвижности полноразвернутыми белковыми цепями. В мертвом состоянии АТФ разрушена, а адсорбированный К⁺ и конгруэнтные анионы, как и молекулы воды, становятся свободными. Однако остается ответить еще на один вопрос. Почему все-таки именно фиксированные катионы, а не Na⁺, являются конечным пунктом в череде взаимодействий, в которые вступают β- и γ-карбоксильные группы при гибели клетки?

Расчеты и соответствующие экспериментальные данные позволяют утверждать, что при низкой «величине с» на известных фиксированных анионах они избирательны к К⁺ в присутствии Na⁺, и наоборот, с ростом «величины с» сродство к Na⁺ возрастает. Трудность в том, что нам неизвестно положение в ряду селективности фиксированных катионов (ε-аминогрупп, гуанидиновых групп и др.). Мы можем лишь предполагать, что оно находится где-то рядом с ионами NH4⁺. Но кривая, рассчитанная для NH4⁺, не дает никаких оснований полагать, что ионы NH4⁺, а, значит, и фиксированные катионы более предпочтительны для фиксированных анионов, чем Na⁺ в условиях, когда связанный К⁺ утрачен из-за критически низкого содержания в клетке АТФ. Может быть, есть еще какой-то механизм, который позволил бы нам объяснить, почему солевые связи между фиксированными зарядами образуются с такой неотвратимостью? Такой механизм действительно существует — он был выявлен при изучении набухания интактных и поврежденных клеток под влиянием различных солей (в частности NaCl).

Чтобы разобраться с этим механизмом, необходимо обратиться к очень простому уравнению Линга, объясняющему набухание клеток в растворе KCl:

где f^- и f⁺ — соответственно фиксированный анион (например, β- или γ-карбоксильная группа) и фиксированный катион (например, ε-аминогруппа или гуанидиновая группа), а X⁺ и Y^- — соответственно свободный катион (например, K⁺) и свободный анион (например, Cl^-).

Подставим в это уравнение вместо Х⁺ ион К⁺, а вместо Y^- — конгруэнтный анион (помощник АТФ). Внутренняя среда интактной клетки представлена поляризованной, ориентированной клеточной водой, а ионное равновесие смещено вправо (когда К⁺ и конгруэнтные анионы адсорбированы). Концентрация свободного К⁺ и конгруэнтных анионов в клетке снижается еще больше не только потому, что они переходят в связанное состояние, но и в результате вытеснения оставшегося свободным К⁺ из клетки структурированной клеточной водой, сравнительно плохим растворителем (величина q для этих ионов принимает низкие значения). Если К⁺ или конгруэнтные анионы спонтанно диссоциируют в покоящейся клетке, то прирост энтропии, вызванный такой диссоциацией, будет сравнительно невелик из-за ограниченной подвижности этих ионов в неподвижной структурированной клеточной воде.

С другой стороны, когда клетка начинает разрушаться из-за падения уровня АТФ (универсальная причина ее трансформаций и гибели), связанный К⁺ начинает замещаться ионами Na⁺ до тех пор, пока этот процесс не достигнет критического уровня, за которым начинается разрушение структурированной воды. До этого переломного момента связанная вода (обеспечивающая низкую величину q), способствовавшая адсорбции К⁺, способствует связыванию и Na⁺ (как в опытах с уабаином).

Но с окончательной утратой АТФ ситуация резко меняется — клетка гибнет, вода из структурированной превращается в обычную воду. Величина q для Na⁺ и конгруэнтных анионов растет, приближаясь к единице, десорбция ионов происходит теперь уже в условиях полной свободы перемещения. Однако присмотримся к фиксированным катионам.

Фиксированные катионы (ε-аминогруппы остатков лизина, гуанидиновые группы остатков аргинина) не могут освободиться от связи с белком и стать свободными при физиологических условиях — они по-прежнему остаются фиксированными (кислотные группы, разумеется, тоже). Поэтому при гибели клетки, деполяризации воды, десорбции К⁺, Na⁺ и конгруэнтных анионов, фиксированные катионы своего статуса не меняют. В конкуренции свободного катиона (Na⁺) и фиксированного катиона за фиксированный анион побеждает последний из конкурентов, потому что фиксированные катионы (как и фиксированные анионы) образуют, как мы уже знаем, более прочные связи именно с фиксированными противоионами. В результате равновесие реакции в уравнении при гибели клетки полностью сдвигается влево, а погибшая протоплазма стягивается солевыми связями во все более плотный белковый матрикс, вплоть до трупного окоченения.